Escherichia coli İçeren Biyoreaktörde Hidrojen Gazı Üretimi

ÖZET

Bu çalışmada çeşitli Esherichia coli (E. coli ) suşlarıyla anaerobic ortamda hidrojen üretimini etkileyen etkenler bir litre hacmindeki bir biyoreaktörde incelenmiştir. E. coli DS 1576 ve E. coli C600 ile hidrojen üretilebilmiştir. Uygun biyoreaktör koşullarının sıcaklığın 37 - 39 ºC ve karıştırma hızının 360 rpm olduğu bulunmuştur. Anaerobik ortam argon gazı ile veya azot gazıyla sağlanabilmektedir. Ayrıca sıvı yüzeyinin sıvı vazelinle kaplanmasının hidrojen üretimini olumsuz etkilemediği anlaşılmıştır. Anaeorobik üretilen mikroorganizma ile aşı yapılmalısının ve aşılama yüzdesinin % 10 olmasının hidrojen üretimi başlama süresini kısalttığı gözlenmiştir. Format ilavesiyle hidrojen üretimi tekrar başlatılmıştır, bu nedenle formatın H2 üretimi mekanizmasında önemli bir yeri olduğu sonucuna varılmıştır.

Anahtar Kelimeler : Biyolojik hidrojen üretimi ; Biyorektör ; Esherichia coli ; Hidrojen

ABSTRACT

Factors affecting hydrogen production under anaerobic conditions by various strains of Esherichia coli (E. coli) have been investigated in a one liter batch bioreactor. Hydrogen gas was evolved by E. coli DS 1576 and E. coli C 600. Optimum bioreactor conditions were found as at a temperature range of 37-39 ºC and at a stirring rate of 360 rpm. Anaerobic conditions could be successfully achieved by using nitrogen atmosphere as well as by argon atmosphere. Addition of a liquid vaselin layer on the surface of the culture did not caused to any negative effect on hydrogen production. Inoculation with anaerobically grown microorganizm at 10% inoculation ratio contributed to decrease the hydrogen production starting time. Format addition to the bioreactor reinitiated the H2 gas production. This result indicated the importance of format in H2 gas production mechanism.

Key Words : Biological hydrogen production; Bioreactor; Esherichia coli ; Hydrogen

1. GİRİŞ

Endüstrileşmiş modern toplumun ekonomik büyümesinde fosil yakıtları kömür petrol ve doğal gazının işlenmesiyle elde edilen enerjinin rolü büyüktür. Bununla beraber , bu yakıtlarının işlenmesinin çevreye verdiği zararlar ve de gelecekte fosil yakıt kaynaklarının azalma tehlikesi içinde oluşu yeni enerji kaynakları arayışını gündeme getirmiştir. Hidrojen gazı temiz enerji kaynağı olarak bu konuda en önemli alternatiflerden biridir. Ayrıca sanayide kimyasal hammadde ve indirgen olarak da büyük miktarlarda kullanılmaktadır. Günümüzde hidrojen üretiminin neredeyse tümü hafif hidrokarbonların su buharıyla tepkimesiyle gerçekleştirilmektedir. Bu işlem esnasında hem tepken hem de enerji kaynağı olarak önemli miktarda fosil yakıt tüketilmektedir. Dolayısıyla eğer hidrojen büyük ölçeklerde , özellikle de enerji kaynağı olarak kullanılacaksa alternatif üretim sistemleri geliştirilmesi gerekmektedir.

Biyolojik sistemlerle hidrojen üretimi gelecek vaadetmektedir . Bu tür sistemlerde üretim nispeten basit proses ekipmanı ve kolay elde edilebilen koşullarda , daha da önemlisi güneş , su ve organik maddeler gibi doğada bolca bulunan veya yenilenebilir kaynaklarla gerçekleştirilebilmektedir. Ne var ki düşük verim ve yüksek substrat maliyeti gibi sınırlamalar şu an için bu tür avantajların önüne geçmektedir.

E. coli Entorobacter ailesine mensup, gram negatif , fakültatifli anaerobik bir mikroorganizmadır. Bu mikroorganizma farklı hidrokarbon bileşiklerinde yaşayabilir. Bulunduğu ortamın koşullarına ve ortamda bulunan alternatif substrat tipine göre en uygun metabolizmasını seçerek kendi üremesi ve yaşamı için en uygun koşulları sağlayan biyokimyasal mekanizmalarını kullanır, gerekmeyen enzimleri sentezlemiyerek enerji tasarufu sağlar.

Aerobik koşullarda rahatlıkla üreyebilen mikroorganizma besin olarak kullandığı glikozu veya ona dönüşebilen diğer karbohidratları EMP (Embden - Meyerhof - Parnas) mekanizması ile piruvata dönüştürür ve daha sonra da triklorik asetik asit devri vasıtasıyla enerji elde eder.

Ortamdaki oksijen miktarı sınırlı olduğunda veya hiç olmadığında bakteri oksijen yerine alternatif elektron tutucuları kullanarak enerji elde etme mekanizmasını çalıştırır. Eğer ortamda oksijen veya alternatif elektron tutucu yoksa, E. coli hidrojen üretimi yaptığı mekanizmasını kullanır. Bu mekanizma sonunda hidrojen ile birlikte etanol, laktat, süksünat gibi başka ürünler oluşur. Şekil 1'de E. coli' nin anaeorobik karbon akış şeması (1) gösterilmektedir.

Aslında E.coli hidrojeni iki ayrı şekilde metabolize eder ; hidrojen kullanımı ve hidrojen üretimi . Her iki metabolizma da anaeorobik koşullarda çalışır ve hidrojenaz enzim aktivitesi gerektirir. Eğer ortamda alternatif electron tutucusu varsa , hücre hidrojeni electron kaynağı olarak kullanır ve hidrojenden enerji elde eder. Hidrojen üretilen metabolizma ise , gene anaeorobik koşullarda , ortamda alternatif elektron tutucu ( fumarat , nitrat , …) yokken çalışır. Bakteri piruvattan ürettiği formatı kullanarak hidrojen ve karbondioksit gazı üretir.

E. coli'de en az 3 hidrojenaz izoenzimi olduğu saptanmıştır (2-3) . Bütün hidrojenazlar hücre zarına bağlı metal içeren enzimlerdir. Hidrojenaz 1 ve 2 hidrojen oksidasyon katalizörü olarak davranmakta ve bu nedenle hidrojen kullanan hidrojenaz (uptake hydrogenase) olarak anılmaktadır. Hidrojenaz 3 ise, formatın hidrojene parçalanması esnasında , format hidrojen layez ( FHL ) yolizinde katalizör görevi üstlenmektedir. Çok yakın bir zamanda hidrojenaz 4 izoenzimi operonu bulunmuştur ancak bu izoenzimin fonksiyonu henüz bilinmemektedir .

Şekil-1 . E. coli'de anaeorobik karbon akışı

Bu çalışma daha once Halobacterium ve E. coli içeren 150 mL'lik bir fotobiyorektörde yapılan hidrojen üretimi araştırmasının devamıdır ( 4-5 ) . Burada sunulan araştırmanın amacı değişik Eschericia coli suşları ile bir litrelik bir biyoreaktörde en uygun hidrojen üretim koşullarının araştırılmasıdır .

2.YÖNTEM

2.1. Deneysel

E. coli'nin üretilmesi için kullanılan yöntem daha önceki araştırmalarda yayınlanmıştır (4-6). Şekil 2'de E. coli ile anaeorobik şartlarda hidrojen üretilen sistemin şeması gösterilmektedir.

Şekil 2. Anaeorobik hidrojen üretim şeması

Bu çalışmada Pyrex camdan yapılmış, 1L'lik biyoreaktör kullanıldı. Biyoreaktörün sıcaklığı , TC 1000 New Brunswick Scientific marka bir sıcaklık kontrolörüyle kontrol edildi. Reaktör ; manyetik karıştırıcı ile karıştırıldı . Başlangıçta biyoreaktörün dibine yerleştirilen bir gaz dağıtıcısıyla kültürden azot veya argon gazı geçirilerek anaeorobik koşullar oluşturuldu. Biyoreaktör çalışma şartları değiştirilerek E. coli ile hidrojen üretiminin en uygun koşulları araştırıldı. Sıcaklık 37 ºC ile 40 ºC arasında, karıştırma hızı 120-360 rpm ,başlangıç pH'ı 6,5-7,1 ve aşılama oranı % 0,5 -%10 aralığında değiştirildi. Aşı aeorobik veya anaeorobik ortamda hazırlandı.

2.2. Bulgular

Biyoreaktörde değişik sıcaklıklarda E. coli DS 1576 ile üretilen toplam gaz hacminin zamana göre değişimi Şekil 3' de verilmektedir. Bu deneyler azot atmosferinde yapılmıştır. Aerobik ortamda üretilen E. coli DS1576 ile aşılama yapılmıştır. Azotsuz bazda elde edilen gaz: 37°C' de: % 97 H2 - %3 CO2; 39 °C' da: % 80 H2 - % 20 CO2; 40 C' de ise: % 100 CO2 içermektedir. Bu sonuca göre 40°C'ta H2 gazı üretilememektedir.

Şekil 3 . Biyoreaktörde değişik sıcaklıklarda üretilen Toplam Gaz Hacminin Zamana Göre Değişimi ( Karıştırma hızı : 360 rpm )

Şekil 4: Değişik çalkalama hızlarında üretilen gaz hacmi (Sıcaklık: 37 °C)

Şekil 4' te değişik çalkalama hızlarında üretilen toplam gaz hacminin zamana göre değişimi gösterilmektedir. Bu deneyler argon atmosferinde yapılmıştır. Aerobik ortamda üretilen E. coli DS1576 ile aşılama yapılmıştır. Argonsuz bazda elde edilen gaz: 37°C'de: % 97 H2 ve %3 CO2 içermektedir. Şekil 4' te görüldüğü gibi aşılama yüzdesinin azalması hidrojen gazı üretim zamanını arttırmaktadır. H2 gazı üretim hızının en çok 0,4 L H2 / (L kültür.saat) olduğu gözlenmiştir.

Şekil 5' te azot ve argon atmosferinde üretilen gaz miktarları karşılaştırılmaktadır. Bu deneyler 37°C sıcaklıkta, 360 rpm karıştırma hızında gerçekleştirilmiştir. Aerobik ortamda üretilen E.coli DS1576 hücreleriyle aşılama yapılmıştır . Aşılama Yüzdesi: % 2,5, üretilen gaz; % 97 H2 ve %3 CO2 içermektedir. Şekilde görüldüğü gibi argon veya azot atmosferinde aynı miktarda H2 üretilmiştir .

Şekil 5. Azot ve argon atmosferinde üretilen gaz miktarlarının karşılaştırılması

Şekil 6'da kültür üzerinin sıvı zarla kaplanmasının ve aşılama yüzdelerinin hidrojen gazı üretimine olan etkisi 38ºC sıcaklık , 360 rpm karıştırma hızı ve 0,8 L kültür hacminde azot atmosferinde araştırılmıştır. Anaeorobik ortamda üretilen E. coli C600 ile aşılama yapılmıştır. Sıvı vazelinin toplam hidrojen üretiminde bir etkisi gözlenmemiştir.azotsuz bazda gaz %93 H2 ve %7 CO2 içermektedir. Aşılama oranının % 2,5'dan %12,5'a arttırılmasıyla hidrojen üretiminin başlama zamanı iki buçuk saatten yarım saate indirilmiştir.

Şekil 6. Kültür üzerinin sıvı zarla kaplanmasının ve aşılama yüzdelerinin hidrojen gazı üretimine olan etkisi

Şekil 7'de format ilavesinin H2 üretimine etkisi gösterilmektedir. Deneyler 38°C sıcaklık , 360 rpm karışma hızında azot atmosferinde gerçekleştirilmiştir. Anaeorobik ortamda üretilen E.coli C600 hücreleriyle aşılanmıştır. Aşılama yüzdesi % 2' dir, üretilen gaz azotsuz bazda % 93 H2 ve % 7 CO2 içermektedir. Biyorektöre 24. ve 48. saatlerde % 0,2 ağırlık/ hacim oranında format ilave edilmiştir. Format ilavesiyle gaz üretimi tekrar başlamıştır. Biyorektörde en yüksek hidrojen üretim hızı 0,65 L H2/ (L kültür.saat) ilk format ilavesinde en yüksek H2 üretim hızı 0,6 L H2/ (L kültür.saat)' dır, ikinci format ilavesinden sonra bu hız 0,3 L H2/ (L kültür.saat) değerlerinde olduğu hesaplanmıştır.

Şekil 7. Format ilavesinin H2 üretimine etkisi

3. SONUÇLAR VE ÖNERİLER

E. coli DS 1576 ve C600 suşları anaeorobik koşullarada H2 üretmiştir.
oUygun biyoreaktör koşullarında , sıcaklık 37 °C - 39 º C ve karıştırma hızı 360 rpm'dir.
oAnaeorobik üretilen mikroorganizma ile aşı yapılmalıdır. Önerilen aşılama yüzdesi %2 ile % 10' dur.
oAnaeorobik koşullar argon veya azot atmosferiyle sağlanabildiği gibi kültür üzerine sıvı vazelin koyarak da sağlanabilir.
oFormatın H2 üretiminde önemli olduğu sonucuna varılmıştır.
Teşekkür : Bu çalışma TBAG 1535 ve ODTÜ - AFP 99-06-02-13 projeleriyle desteklenmiştir.

4. KAYNAKLAR

Gunsalus, R. P. and Park, S.J., "Aeorobic - anaeorobic gene regulation in E. coli: Controlled by the ArcAB and Fnr regulons", Research in Microbiology, 145 (5-6): 437-450, 1994.
Sode, K., Watanabe, M., Makimoto, H., and Tomiyama, M., " Effect of Hydrogenase 3 over-expression and disruption of nitrate reductase on fermantative hydrogen production in Escherichia coli, A metabolic Engineering Approach", in: "Biohydrogen", O. R. Zaborsky ed., Plenum Press, New York, USA, 1998.
Sawers, R.G., Balantine, S.P., and Boxer, D. H., "Differential Expression of Hydrogenase Isoenzymes in Escherichia coli, K-12: Evidence for a third Isoenzyme", J.Bacteriol, 164: 1324-1331, 1985.
Kaya, B., " Hydrogen gas production by Halobacterium halobium coupled to E. coli in a Photobioreactor ", Orta Doğu Teknik Üniversitesi, Yüksek Lisans Tezi, Ankara, 1995.
Kaya, B., Gündüz, U., Eroğlu, İ., Türker, L. and Yücel, M., " Hydrogen gas production using coupled enzyme systems from E. coli and H. halobium", in: "Proceedings of 11th World Hydrogen Energy Conference", T. N. Veziroğlu, C. J., Winter, J. P., Baselt and G., Kreysa eds. , Volume 3: 2595 - 2600, 1996.
Eroğlu, İ., Yücel, M., Gündüz, U., Türker, L., Sediroğlu V., Kaya B., Aydemir, A., "Güneş enerjisi ile hidrojen gazı üretimine yönelik bir biyoreaktörün tasarımı ve geliştirilmesi", KTÇAG 115 Nihai Rapor, Ankara, 1996.
Bora, K., " Hydrogen Gas Production by Escherichia coli in a Bioreactor ", Orta Doğu Teknik Üniversitesi, Yüksek Lisans Tezi, Ankara, 2000.